微生物生长曲线分析仪菌密度的小知识：大小和形状的影响

上过微生物相关课程的同学，大抵都对菌液的OD600测量还有点印象：需要将样本稀释到合适的浓度，然后取样置于比色皿内，在分光光度计中测量600nm波长下的OD值。此外，也会有一个模糊的印象，当OD为1时1mL菌液中大概对应了多少数量的细胞。

网络搜索1 OD与菌液浓度的对应关系时，发现给到的数据区间非常大，从1×10^7 ~2×10^9 cells/mL不等，但基本都会提到需要结合具体的菌种进行分析，培养物中细菌细胞的大小和形状会对OD600数值产生影响。

细胞大小对OD600的影响

Keiran Stevenson等研究人员制备了不同直径的微珠的分散溶液（图1），每种溶液的浓度和吸光度之间的标准曲线如图2A所示，在相同的OD600数值情况下，随着微珠的直径减小，对应的微珠浓度显著增加（图2B）。

▲图1 微珠的明场图像。A：15.7±1.4 μm；B：10.0±0.6 μm；C：3.00±0.07 μm；D：0.96±0.07 μm；E：0.51±0.01 μm。E中给出的刻度尺适用于A-E。

▲图2  球形微珠悬浮液的OD600测量。（A）对于给定的珠子直径，微珠悬浮液的浓度与OD600之间的关系。（B）微珠浓度与微珠直径之间的关系，同一条曲线上的点拥有相同的OD600值，随着箭头的方向，曲线从黑到红分别对应以下OD600值：0.05、0.1、0.5、1和10。每组5个重复，由于差异较小，部分数据重叠。

细胞形状对OD600的影响

Keiran Stevenson等研究人员还研究了真实的微生物形状和大小对OD600的影响。不同遗传背景的酵母、不同生长环境的大肠杆菌的显微镜图片如图3所示：酵母二倍体的体积大于酵母单倍体（图3B-D）；大肠杆菌在亚致死浓度氨苄西林（ampicillin）的作用下被诱导成丝状（图3E）；对数生长期的大肠杆菌繁殖活跃，个体较大（图3F）；稳定期后期部分细胞死亡，个体较小（图3H）；稳定期前期的大肠杆菌体积处于两者之间（图3G）。

▲图3  在显微镜下获得的不同微生物的代表性图像。（B）酵母CLN3Δ纯合二倍体突变体；（C）酵母二倍体；（D）酵母单倍体；（E）在亚致死浓度氨苄西林（ampicillin）存在下生长的大肠杆菌细胞，呈丝状；（F）对数生长期的大肠杆菌细胞；（G）稳定期早期的大肠杆菌细胞；（H）稳定期晚期的大肠杆菌细胞。B中给出的刻度尺适用于B-H。

这些微生物培养液的浓度和吸光度之间的标准曲线如图4所示，与正常的大肠杆菌样品相比，经抗生素氨苄西林诱导的丝状大肠杆菌细胞的校准曲线变化较大。酵母（细胞尺寸4~6μm）的细胞大小变化对校准曲线的影响要比细菌（细胞尺寸0.7~1.5μm）的影响要小。

 ▲图4  微生物浓度与OD600之间的关系。酵母CLN3Δ纯合二倍体突变体（深灰）、酵母二倍体(浅灰)、酵母单倍体(紫色)、丝状大肠杆菌(绿色)、以及对数生长期（黑色）、稳定期早期(蓝色)和晚期(红色)的大肠杆菌。

综上所示，微生物的形状和大小都会对OD600测量产生影响，因此当需要通过OD600来估算菌液浓度时，不同的微生物需要单独制作标准曲线。

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参考文献

Stevenson K ,  Mcvey A F ,  Clark I , et al. General calibration of microbial growth in microplate readers[J]. Scientific Reports, 2016, 6:38828.